eLife丨Ribo-seq应用：脆性 X 染色体综合征致病蛋白 FMRP，原来不是 “逼停核糖体” 的凶手？

前言：

神经元有一个非常特别的现象：树突、轴突离胞体距离很远，很多 mRNA 需要被运输到突触远端，在局部合成蛋白，以此调控突触可塑性。为了避免 mRNA 在运输途中就提前翻译，神经元会把 mRNA 连同已经发生延伸停滞的核糖体一起打包进入 RNA 颗粒进行转运。

脆性 X 染色体综合征（Fragile X syndrome）是最常见的遗传性自闭症，它的致病蛋白FMRP，长期被认为是这个过程的核心分子。经典模型认为 FMRP 识别 mRNA 特定基序，一把拽住核糖体，强行让翻译停下来，以此控制神经元蛋白合成。

然而，后续的研究发现，神经元 RNA 颗粒分离得到的停滞核糖体，它的核糖体保护片段（RPF）大量出现 FMRP 结合的序列。 这说明还有另一种完全相反的可能性存在：mRNA 本身的序列就会诱发核糖体停滞，这之后 FMRP 才过来结合这些已经停滞的复合物。

因此，为了解开这个核心矛盾，Wayne S. Sossin团队在 eLife 发表的论文证明了 FMRP 根本不是那个 “踩刹车” 的人。核糖体自己就会停下来，而 FMRP 的任务是把这些已经停下的核糖体保护在 RNA 颗粒里，等待突触信号再重新启动翻译。

01 删掉 FMRP，核糖体照样会 “踩刹车”

研究人员首先选用 FMR1 敲除小鼠做实验，以保证小鼠体内的 FMRP 蛋白被完全清除。如果 FMRP 是逼停核糖体的元凶，敲除之后，核糖体停滞现象应该会大幅消失。

但是生化和电镜的结果显示：没有 FMRP，核糖体簇照样组装；神经元核糖体特有的药物抗性特征（茴香霉素抵抗的嘌呤霉素标记）也完好保留。因此 FMRP 并不是核糖体 “踩刹车” 这个动作所必需的蛋白。

定量柱状图，证明茴香霉素‑嘌呤霉素抵抗表型在 WT/KO 无差异

02 Ribo‑seq 寻找核糖体的停滞位点

那核糖体到底停在哪里？这就要轮到 Ribo‑seq 登场。研究人员分别对野生型、FMRP 敲除小鼠的 RNA 颗粒组分别做 Ribo‑seq 测序，全转录组比对核糖体停滞的 RPF 峰。

如果旧假说正确：敲除 FMRP 之后，很多核糖体停滞的位置就会消失或者移位。

可测序结果出人意料：绝大多数核糖体停滞的位置，在有或无 FMRP 的条件下都高度重合！哪怕这些位点依然富集 FMRP 识别的 RNA 序列。拿 Tubb2b 基因举例，不管有没有 FMRP 蛋白，Ribo‑seq 检测到核糖体扎堆停滞的位置几乎一模一样。

这说明决定核糖体在哪里停下的，是 mRNA 自身的序列，而不是 FMRP 蛋白。Ribo‑seq 看到的序列重合，只是 “相关性”，并不是直接的因果证据。

Tubb2b 基因 RPF 覆盖峰图，直观对比 WT / FMR1‑KO 核糖体停滞峰位置高度重合

03 FMRP 真正在干什么？

Ribo‑seq 虽然可以精准定位核糖体停在 mRNA 的哪个位置，但是并不能看到核糖体‑mRNA 复合物是不是待在 RNA 颗粒里面，也看不到颗粒的数量和动态变化。

这时就要靠 RPM (ribopuromycylation) 原位成像技术做补充，这个技术可以标记神经元突起中携带停滞核糖体的 RNA 颗粒。同时， HHT（同型 harringtonine）可以让正在翻译的核糖体停滞；DHPG（mGluR 激动剂）则可以激活停滞核糖体重新启动翻译。成像发现，敲除 FMRP 之后，含有停滞核糖体的 RNA 颗粒数量明显变少；剩下的颗粒，则对突触传来的激活信号完全没有反应。

研究人员据此提出一个猜想：FMRP通过维持液‑液相分离（liquid‑liquid phase），将停滞核糖体保留在 RNA 颗粒内部；FMRP 的翻译后修饰介导颗粒可控解聚，从而实现翻译重新激活。在缺失 FMRP 的情况下，RNA 颗粒会发生提前解聚，造成原本停滞在神经元 RNA 颗粒中的 mRNA 过早进行蛋白翻译。

    RPM 点状信号密度的定量统计

结语

过去我们认为 FMRP 找到特定 RNA 序列，主动让核糖体停滞，以此抑制翻译。但是该文证明，核糖体停滞位置是 mRNA 自身序列决定的；FMRP 不会去设定停滞位点，它只会结合已经停滞的核糖体。

这项工作提醒我们：当我们看到 RPF 富集某个 RBP 结合序列的时候，要区分两件事 ——这个蛋白是造成停滞的原因，还是仅仅结合已经停滞的产物。这个思路也可以借鉴到其他 RNA 结合蛋白与核糖体停滞的研究中。

原文链接：

https://elifesciences.org/articles/106692