Science丨破解致命出血热病毒聚合酶结构，两条抗病毒研发路线同步出炉

前言：

克里米亚 - 刚果出血热病毒（CCHFV）是蜱传播的烈性出血热病毒，全球近 30 亿人有感染风险，感染后重症患者会全身多器官大出血，病死率最高可达 50%。目前全世界没有获批疫苗、没有特效治疗药物，被 WHO 列为最高优先级亟待开发医疗手段的高危病原体。

病毒复制的核心机器是 L 蛋白聚合酶，也是最理想的抗病毒靶点，但这个蛋白有两个巨大研究难点：

第一，它是已知尺寸最大的布尼亚病毒聚合酶，分子量高达 450 kDa，结构一直无法解析；

第二，现有的候选药物（巴洛沙韦、核苷类化合物）抑制靶点、分子机理完全不清楚，没法开展精准药物优化。

近日，中科院、山大联合团队在《Nature》发表里程碑工作：首次完整解析 CCHFV 全长超大聚合酶多构象冷冻电镜结构，搭建体外复制实验体系，从原子层面阐明两类完全不同抗病毒小分子的抑制机理，为烈性出血热药物开发提供全套结构蓝图。

01 搭建体外实验平台：搞定超大病毒蛋白纯化与复制检测

想要解析超大聚合酶的三维结构，第一步要拿到高纯度、有活性的全长蛋白。研究团队选用昆虫杆状病毒表达系统，搭配双亲和标签两步纯化策略，成功分离出均一单体 CCHFV-L 蛋白。

团队还发现一个关键技术卡点：病毒天然 5’、3’端 RNA 启动子序列高度互补，会自发形成双链结构，直接阻断聚合酶启动复制；缺失聚合酶、5’vRNA、3’vRNA 任意一种组分，反应都不会产生 RNA 产物，仅添加单一 CTP 只能延伸 1 个碱基，完整三核苷酸体系才能合成全长 9 nt RNA，直观证明两端病毒 RNA 是复制启动的必需开关。

建立全长 CCHFV-L 蛋白表达纯化方案

02 原子级全景：超大聚合酶独特三维分子机器

有了成熟生化平台，团队借助冷冻电镜解析了 7 套聚合酶近原子结构，将蛋白划分为特有 N 端区、PA/PB1/PB2 四大模块，内部形成四条独立核酸转运通道。

同时研究新发现锌离子结合口袋、次级 3’RNA 结合位点两大关键功能区；细胞微型复制子实验进一步验证，两处位点、5’RNA 口袋的关键残基突变后，病毒复制活性近乎完全丧失。

近原子分辨率活性聚合酶三维模型

03 RNA 延伸底层逻辑：复制时蛋白如何同步组装？

通过对比游离蛋白与 RNA 延伸状态的结构，团队摸清了病毒 RNA 驱动聚合酶构象重排的底层逻辑。未结合核酸时，催化口袋周边掌、指、拇指结构域松散无序；当模板-产物 9 bp 双链填入活性中心，掌域 A-D 保守基序向外张开，指域 F-G 基序有序固定，拇指原初环完全伸出，Lid 与桥结构堆叠在 RNA 双链上游，物理分隔模板链与新生产物链，避免核酸缠绕。

更有意思的是，RNA 延伸会驱动全部外周柔性结构域有序贴合核心，实现复制、帽抢夺同步运作，揭示聚合酶协同工作的全新调控模式。

模板 RNA 入口、模板出口、产物 RNA 出口、NTP 底物进入通道，四条通道互不干扰

04 两条抗病毒路线！两类小分子抑制原子机制

基于结构解析结果，研究团队完整披露两条独立抗 CCHFV 药物研发路径，分别靶向病毒转录、复制两大核心环节。

第一条路线瞄准病毒帽抢夺内切酶，代表分子是大环改造化合物 WXSH0208，它靶向转录必需内切酶，可竞争性封堵底物口袋、螯合催化金属；其在体外实验中对酶切割活性的抑制效果优于巴洛沙韦，但细胞膜穿透差，细胞药效有限。

第二条路线是核苷类抑制剂 2’-脱氧-2’-氟胞苷（2FC），也是全文最优候选分子。仅核糖二 号位羟基替换为氟原子的微小修饰，就让它达到 75.7 nM 的纳摩尔抗病毒活性，选择性指数超 1980，药效是 WXSH0208 的 56 倍。2FC 可正常掺入 RNA，但 2’ 氟破坏催化氢键，形成独特转位后链终止效应，抗病毒活性极强且低毒。

WXSH0208-内切酶结合界面

结语

这项研究首次解析内罗病毒完整聚合酶多态结构，发现全新可成药锌靶点，填补领域空白；同时验证内切酶、RdRp 双类药物骨架，配套全套蛋白、结构、药效实验范式，做到基础病毒学与抗感染药物研发双向突破。后续可优化小分子理化性质、探索联合给药，为 CCHFV 特效药研发铺平道路。