1. 样品处理。

a. 石蜡包埋组织蜡块：手术刀切或刮取约10-25 mg的组织样品（尽量去除组织周围的石蜡块）。

b. 石蜡包埋组织切片：取5-8张的石蜡切片（5-10 μm厚，表面积小于1×1cm²）。

c. 福尔马林固定组织：取10-25 mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5 ml离心管中，加入500 μl的PBS，pH7.4 （DNase, RNase & Protease free, Sterile），Vortex震荡混匀，12,000×g离心1 min后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2b开始操作。

注：

1) 较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效率提高。

2) 如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。

2. 脱蜡和裂解。

a. 将石蜡块样品或者石蜡切片置于1.5 ml离心管中，加入600 μl的脱蜡剂，剧烈Vortex 30 sec，以充分脱蜡。

b. 加入180 μl样品裂解液A和20 μl蛋白酶K，Vortex混匀，56ºC金属浴或水浴孵育1 h或直至样品完全裂解。

c. 将完全裂解的组织样品置于90ºC孵育1 h，之后短暂离心使盖子上的蒸发液体回到管中。

d. 将离心后的离心管室温静止5 min，用吸头缓慢穿过上层脱蜡剂，吸取下层的澄清液体（约180 μl）至新的离心管中。

e. 清除RNA（可选做）。如果希望获得不含RNA的高纯度DNA，加 入 2 μl的RNase A （100 mg/ml, DNase free），Vortex混匀。室温放置2 min后，进行下一步操作。

f. 向上述新的离心管中加入200 μl样品裂解液B，Vortex混匀；再加入200 μl无水乙醇，Vortex混匀。

注：

1) 福尔马林固定液中的组织样品无需加脱蜡剂，直接转入步骤2b开始操作；如果石蜡样品过多，可以将脱蜡剂用量增加至1 ml。

2) 裂解过程中可多次从金属浴中取出离心管颠倒混匀以促进裂解。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3 h内完成。为方便起见，可以直接过夜裂解，过夜裂解对DNA抽提效果通常无负面影响。

3) 90ºC孵育对解开DNA与其它分子的交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的DNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至90ºC再放入样品进行孵育。

4) 如果残余的少量RNA对后续下游实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤2f。

5) 加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀，但不会干扰后续实验；加入无水乙醇后也可能产生白色沉淀，必须Vortex充分混匀，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！

3. 纯化DNA。

a. 将步骤2f中的混合溶液加入到DNA纯化柱内，≥6000×g（约≥8000rpm）离心1 min，倒弃废液收集管内液体。

b. 向纯化柱中加入500 μl洗涤液I，≥6000×g（约≥8000rpm）离心1 min，倒弃废液收集管内液体。

c. 向纯化柱中加入600μl洗涤液II，≥18,000×g（约≥12,000 rpm）离心1 min，倒弃废液收集管内液体。

d. 重复步骤3c一次。

e. 再≥18,000×g（约≥12,000 rpm）离心1 min，以去除残留的乙醇。

f. 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5 ml离心管上，加入30-100 μl洗脱液，室温放置1-3 min。≥18,000×g（约≥12,000 rpm）离心1 min，所得液体即为纯化得到的总DNA。

注：

1) 进行步骤3a、3b、3c前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。

2) 不可把步骤3d的离心时间延长而省略步骤3e，倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。

3) 洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。洗脱液的pH对洗脱效率有很大影响，使用去离子水洗脱时应保证其pH值在7.0-8.5之间。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次洗脱后，再用同体积洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可增加DNA洗脱量，但会降低洗脱DNA的浓度。经65ºC预热过的洗脱液可增加DNA的洗脱量。