1. 样品处理。

a. 石蜡包埋组织蜡块：手术刀切或刮取约10-25 mg的组织样品（尽量去除组织周围的石蜡块）。

b. 石蜡包埋组织切片：取5-8张的石蜡切片（5-10 μm厚，表面积小于1×1cm²）。

c. 福尔马林固定组织：取10-25 mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5 ml离心管中，加入500 μl的PBS pH7.4（DNase, RNase & Protease free, Sterile），Vortex震荡混匀，12,000×g离心1 min后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2b开始操作。

注：

1) 较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效率提高。

2) 如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。

2. 脱蜡和裂解。

a. 将石蜡块样品或者石蜡切片置于1.5 ml离心管中，加入600 μl的脱蜡剂，剧烈Vortex 30 sec，以充分脱蜡。

b. 加入180 μl样品裂解液A和20 μl蛋白酶K，Vortex混匀，56ºC金属浴或水浴孵育1 h或直至样品完全裂解。

c. 将完全裂解的组织样品置于90ºC孵育1 h，之后短暂离心使盖子上的蒸发液体回到管中。

d. 将离心后的离心管室温静止5 min，用吸头缓慢穿过上层脱蜡剂，吸取下层的澄清液体（约180 μl）至新的离心管中。

e. 清除RNA（可选做）。如果希望获得不含RNA的高纯度DNA，加 入 2 μl的RNase A （100 mg/ml, DNase free），Vortex混匀。室温放置2 min后，进行下一步操作。

f. 向上述新的离心管中加入200 μl样品裂解液B，Vortex混匀；再加入400 μl异丙醇，Vortex混匀。

注：

1) 福尔马林固定液中的组织样品无需加脱蜡剂，直接转入步骤2b开始操作；如果石蜡样品过多，可以将脱蜡剂用量增加至1 ml。

2) 裂解过程中可多次从金属浴中取出离心管颠倒混匀以促进裂解。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3 h内完成。为方便起见，可以直接过夜裂解，过夜裂解对DNA抽提效果通常无负面影响。

3) 90ºC孵育对解开DNA与其它分子的交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的DNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至90ºC再放入样品进行孵育。

4) 如果残余的少量RNA对后续下游实验没有干扰，可以不进行步骤2e，直接进入步骤2f。

5) 加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀，但不会干扰后续实验；加入异丙醇后也可能产生白色沉淀，必须Vortex充分混匀，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，否则会严重影响抽提效果！

3. 纯化DNA。

a. 向步骤2f中的混合溶液加入20 µl磁珠悬浮液（使用前务必混匀），轻柔混匀后，室温放置3-5 min。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。

b. 加入500 µl洗涤液Ⅰ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒两次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。

c. 加入600 µl洗涤液Ⅱ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒两次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。

d. 重复步骤3c一次。

e. 将离心管室温放置5-10 min，或置于37ºC鼓风烘箱5 min，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。

f. 加入50-100 μl洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3-5 min，其间甩动离心管1-2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20ºC保存。所得溶液即为纯化的总DNA。

注：

1) 磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量或延长结合时间以提高得率。

2) 如果有必要，可以使用去离子水洗脱DNA，洗脱液的pH对洗脱效率有很大影响，使用去离子水洗脱时应保证其pH值在7.0-8.5之间。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次洗脱后，再用同体积洗脱液重复洗脱一次，第二次洗脱可增加DNA洗脱量，但会降低洗脱DNA的浓度。或将洗脱后的得到溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次。经65ºC预热过的洗脱液可增加DNA的洗脱量。