2X Multiplex PCR Master Mix

多重PCR/2X Multiplex PCR Master Mix

一种使用特别便捷的专门用于多重PCR扩增的2倍浓度的PCR预混液，PCR结束后可以直接上样电泳无需添加上样缓冲液。

产品货号	产品规格	目录价	促销价
HX1017S	100次	999.00	899.00
HX1017M	500次	3763.00	3386.00

▍产品信息

2X Multiplex PCR Master Mix，是一种使用特别便捷的专门用于多重PCR扩增的2倍浓度的PCR预混液，并且PCR结束后可以直接上样电泳无需添加上样缓冲液。本产品含有Multi DNA polymerase，可以高效、高特异性和高灵敏度的适用于对多个（可以超过20个）目标DNA片段同时进行非常均衡的PCR扩增。多重PCR是一种通过单个PCR反应同时对至少两个或多个DNA片段进行扩增的PCR技术。目前该技术已被广泛应用于科学研究、疾病诊断和法庭或诊断性的基因分型（Genotyping）等多个领域。还可以被用于以cDNA为模板的基因定量或半定量的表达分析，其特别适合于各种动植物、真菌、细菌或病毒等微量样品进行多基因检测，具备高特异性和高灵敏度的突出优点。

本产品多重扩增性能优越。普通的PCR试剂盒会由于PCR扩增时引物和模板的偏好性，对于不同的引物和不同的模板会产生不同的扩增效率，导致部分片段容易被扩增，而部分片段较难被扩增。本试剂盒使用了通过精心筛选和突变优化的非常适合用于多重PCR的DNA聚合酶Multi DNA polymerase和反复优化的配套缓冲液，确保可以实现多个目标DNA片段的高效、高特异性和高灵敏度的均衡扩增。本产品兼容血液和植物样品，全血或血清样品无须进行DNA的提取和纯化，即可直接作为模板用于本试剂盒的多重PCR检测。本产品适用于EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝血样品或干血斑样品。植物样品也可以直接用于本试剂盒的多重PCR检测，完全无须对植物样品进行DNA的提取和纯化。本产品提供了阳性对照，便于验证本产品的效果。提供了Control template and primer mix，预先混合了模板和引物，Control template and primer mix中包含了15对引物，可以作为阳性对照用于验证确认本产品的多重PCR扩增效果。使用便捷，仅需添加引物、模板和水即可进行多重PCR，并且PCR结束后可以直接进行电泳检测，无需添加上样缓冲液。扩增产物可以用于TA克隆，获得的PCR产物带有3'-dA overhangs的粘性末端，可直接用于与T载体连接进行TA克隆。Multi DNA polymerase的保真性和Taq DNA聚合酶相近，因此本产品主要推荐用于定性和半定量检测。如果用于20 µl的PCR反应体系，两种包装分别足够用于100个和500个反应。

▍产品应用

本产品不仅可以用于普通的多重PCR，更可以用于全血、血清或植物样品的直接PCR，便于直接用于血液样品中细菌和病毒感染、基因突变等的多重PCR检测，或者用于植物样品的基因突变、微生物感染等的多重PCR检测。

▍产品保存

-20℃保存。

▍产品组分

组分编号	组分名称	组分规格
HX1017-1	2X Multiplex PCR Master Mix	1 ml	1 ml×5
HX1017-2	Control template and primer mix	25 μl	50 μl

▍注意事项

1. 引物设计对于多重PCR的成功与否至关重要。引物的设计一方面需要满足常规的引物设计规则，避免出现非特异性扩增和无法扩增，设计好的引物对应逐一通过PCR验证，然后才能选择效果较好的引物对用于多重PCR。并且引物的设计在尽可能的情况下，如果Tm值按照Tm = 2n(A) + 2n(T) + 4n(G) + 4n(C)进行计算(例如一条引物含有3个A、7个T、4个G和6个C，那么Tm = 2X3 + 2X7 + 4X4 + 4X6 = 60)，Tm值不能低于60ºC，通常按此计算Tm不低于65ºC时用于多重PCR的效果会更佳。

2. 推荐使用高质量引物（经脱盐处理、PAGE或HPLC纯化），建议使用前预先混合所用所有引物对，调整各对引物母液浓度均达到10 μM，最终使其在PCR反应体系中终浓度达0.2 μM。

3. 推荐的延伸速度为2 min/kb，对于较难扩增的靶序列，可适当调整延伸时间为3-4 min/kb。如果PCR产物条带较多，建议PCR反应后电泳检测的上样量调整为约2 μl，过多的上样量容易导致电泳条带不太平整。

4. 由于多重PCR反应非常灵敏，在使用本产品时请注意避免微量待扩增DNA的污染，建议设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

5. 对模板GC含量过高的情况，推荐使用HX1016 多重PCR试剂盒和HX1032 2X Multi PCR Enhancer配套使用。

6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 引物设计：引物设计对于成功进行多重PCR至关重要，建议使用适当的引物设计软件进行引物设计：

a. 引物的长度通常为20-30个核苷酸。

b. GC含量为40-60%（优选45-55%）。

c. 避免所用的多个引物的3'末端出现互补序列，避免引物3'末端有3个或更多的G / C，避免引物内的二级结构。

d. 在尽可能的情况下所用引物的Tm值应不低于60ºC，推荐在Tm值在65-68ºC之间更佳，引物间的Tm值差异应控制在5-6ºC 以内。此处提到Tm值按照Tm = 2n(A) + 2n(T) + 4n(G) + 4n(C)进行计算，例如一条引物含有3个A、7个T、4个G 和6个C，那么Tm = 2X3 + 2X7 + 4X4 + 4X6 = 60。

e. 建议扩增的目标片段不超过1500 bp。虽然目标片段大约1500 bp时也能被很好地扩增，但过长的片段和较短的片段同时进行PCR扩增，相对更容易产生亮度不太均匀的条带。

f. 建议使用经过脱盐、PAGE或HPLC纯化的引物，并溶于TE buffer（10 mM Tris-Cl,1 mM EDTA, pH 8.0）。

2. 引物的配制：每种合成的引物推荐配制为100 µM，然后每个引物对1:1混合并加入适量水配制成10 µM的引物对。

例如，如果合成得到的一个 5’端引物A的量是20 nmol，另外一个相应的3’端引物B的量是19 nmol。在引物A中加入200 µl水或TE，配制成浓度为100 µM，在引物B中加入190 µl水或TE也配制成浓度为100 µM。吸取20 µl 100 µM引物A和20 µl 100 µM引物B到一新的离心管中，再加入160 µl水，混匀后即可得到可以直接用于多重PCR的引物对（10 µM each）。

3. 多重PCR扩增:

a. 反应体系的设置。融解并混匀置于冰浴上或冰盒内。参考下表设置PCR反应体系。可根据情况，将多对引物进行等浓度预混合。

试剂	体积	对照	最终浓度
Nuclease-Free Water	（25-x-n）μl	12.5 μl	-
2X Multiplex PCR Master Mix	25 μl	25 μl	1X
Primer mix（10 μM each）	1 μl×n	-	0.2 μM each
Template	x μl	-	-
Control template and primer mix	-	12.5 μl
Total volume	50 μl	50 μl	-

b. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油。把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应，PCR反应的设置可以参考如下表格。

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5 min	1
变性	94℃	30 sec	30-40
退火	60℃	30 sec
延伸	68℃	2 min/kb
最终延伸	68℃	10 min	1

注：

1) 代表多重PCR时使用的引物对种类的数量，即拟扩增片段种类的数量。

2) DNA模板的用量对PCR扩增有很大影响。对于高复杂度的DNA样本，如哺乳动物基因组DNA，推荐在20 μl反应体系中使用5 ng至0.5 μg模板DNA。对于低复杂度的DNA，如λDNA或质粒DNA，推荐在20 μl反应体系中使用5 pg至5 ng的模板DNA。

3) PCR模板为抗凝血时，模板的用量一般为PCR反应体系总体积的1-20%，建议起始使用量为5%；如果抗凝血多重PCR反应检测的是基因组的DNA片段，可以适当减少抗凝血用量；如果抗凝血多重PCR反应检测的是血液样品中某种病毒或细菌等微生物的目的DNA片段，建议使用50 μl的PCR体系，并使用较大的模板血量。对于高GC含量的PCR扩增，可以使用扩增高GC含量DNA片段的HX1032 2X Multi PCR Enhancer，或者尝试向PCR体系中加入终浓度1-10%（体积百分比）的DMSO。对于干血斑样品，20 μl和50 μl的PCR体系中分别推荐使用约 0.8 mm²和2 mm²的干血斑。

4) 对于20 μl和50 μl PCR反应体系，植物样品的推荐用量分别为 0.1-1 mm和0.3-3 mm直径叶片或类似大小其它比较柔嫩的植物组织。如果模板为植物种子，尽量使用鲜嫩的植物种子。用干净的解剖刀去掉种子外壳，剪下直径约0.5-2 mm的组织直接放入PCR管内；若种子太小，如番茄种子，可直接使用1-2粒完整的种子放入PCR管内进行扩增。50 μl PCR体系，植物叶片或是种子直径不宜超过3 mm，太多模板易造成PCR抑制成分偏多，影响PCR效果。推荐取两份植物组织样品进行平行的PCR实验，以降低取样的不稳定性。为确保取样的均一性，建议使用专用的打孔器或解剖刀进行取样，并注意防止取样过程中的交叉污染。每一次取样，可以用2%的次氯酸钠溶液清洗打孔器或解剖刀。对于高GC含量的PCR扩增，可以尝试向PCR体系中加入终浓度1-10%（体积百分比）的DMSO。

5) 通常引物的终浓度为0.2 μM时可获得良好的PCR扩增效果，但也可以根据情况在0.05-0.4 μM范围内调整引物的终浓度。扩增效率低的情况下，可提高引物浓度；发生非特异性扩增时，可降低引物浓度。

6) 需根据每次反应的模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等适当优化PCR反应条件，包括退火温度、退火时间、循环数等。通常退火温度可在55-60ºC范围内适当调整，或者可以对退火温度采用Touch down的方式，确保退火效果良好。

7) 对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。后续可以根据实际的PCR效果适当调整循环数。

4. 电泳检测。

多重PCR反应结束后，即可进行常规的凝胶电泳检测（对于植物等比较特殊的样品，如有必要，可以离心取上清进行电泳）。

下载产品使用说明书

Q：杂带较多或条带弥散怎样做？

A：退火温度提高 2-5°C，适当检测PCR的循环数，适当减少模板的用量，在室温配制PCR体系容易产生非特异性条带，推荐在冰浴上配制PCR反应体系，适当减少Multi DNA Polymerase的用量，加入适合扩增高GC含量DNA片段的HX1032 2X Multi PCR Enhancer，适当缩短延伸时间。

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