1. DNA模板的准备

本试剂盒体外转录的DNA模板需要使用带有SP6或T7 Promoter的线性化质粒DNA、PCR产物或合成的DNA片段等；正义或反义RNA的合成取决于插入序列的方向。将靶序列置于Promoter的下游，在转录时将以双链DNA的反义链为模板转录获得正义RNA，即转录获得的RNA的序列对应于插入的DNA片段的正义链（图1）。

图1. Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7) 转录反应示意图。SP6 RNA Polymerase催化的基于SP6 Promoter的RNA转录反应（图A）；T7 RNA Polymerase催化的基于T7 Promoter的RNA转录反应（图B）。

a. 质粒DNA模板的准备

携带SP6或T7 Promoter的线性化质粒可以作为转录模板。抽提获得高纯度质粒DNA后，用适当的内切酶消化过夜，然后进行DNA柱纯化或苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。在质粒DNA内切酶消化过夜后进行DNA凝胶电泳和切胶回收线性化质粒DNA的效果通常是比较理想的选择。确保获得线性质粒DNA的更有效方式是，在酶切位点处插入一段比较大的DNA片段，后续双酶切去除该大片段，同时确保酶切后的位点刚好在所需位点处，这样后续通过凝胶电泳很容易回收获得高纯度的线性化质粒DNA模板。

b. PCR产物模板的准备

携带SP6或T7 Promoter的PCR产物也可以作为本试剂盒用于体外转录的模板。在PCR扩增模板时将SP6 Promoter (ATTTAGGTGACACTATAG)或T7 Promoter (TAATACGACTCACTATAGGG)加在上游引物的5'端。转录前，建议对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以评估PCR反应的特异性和产量；尽管可以直接使用PCR产物作为模板，但使用纯化的PCR产物往往可获得更高的产量；根据PCR产物长度的不同，在20 µl体外转录反应中可以使用0.1-0.5 µg PCR产物。

c. 合成的DNA模板

合成的带有SP6/T7 Promoter的双链（通常通过退火反应获得）可以作为体外转录的模板，或者合成的仅SP6/T7 Promoter为双链而其余的反义链为单链的DNA片段也可以作为体外转录的模板。

注：

1) 质粒的线性化程度和纯度都会影响RNA转录产物的产量以及完整性。为了产生确定长度的RNA转录产物，质粒DNA需要通过限制性内切酶消化在待转录插入片段的下游进行线性化处理。线性化质粒DNA作为模板时要尽量确保是平末端或5'端突出（5' overhang），尽量避免3'端突出（3' overhang）。如果出现3'端突出的情况，模板DNA需要用Klenow片段或T4 DNA Polymerase处理成平末端后再进行转录反应或者需要重新设计质粒线性化的酶切位点。

2) 由于SP6/T7 RNA Polymerase的高聚合力，与线性DNA模板相比，环状质粒模板会产生更长的异质化的RNA转录产物。因此，重要的是要把环状质粒充分线性化或者线性化后进行凝胶电泳和胶回收以获得高纯度的线性化DNA模板，从而确保转录产物长度和预期的完全一致。

3) 以线性化质粒DNA作为模板时，每个20 µl反应体系建议使用1 µg的线性化质粒DNA。质粒线性化后，需要纯化后再作为体外转录的模板，这样可以避免酶、蛋白、盐等的残留对转录体系的影响。

2. 生物素标记RNA的合成：

解冻必要的试剂盒组分，混匀后快速离心一下，将溶液沉淀至离心管底部。如果需进行多个反应，除模板外可以进行预混和再分装到各个反应管内，同时在配制预混液时需要注意把RNA Polymerase在其它组分混合后再最后加入。反应体系通常为20 µl，但可以根据需要按比例扩大反应体系。参考下表设置反应体系，混匀后快速离心一下，将溶液沉淀至离心管底部，37ºC孵育2 h。

（可选）DNase处理去除DNA模板。20 µl反应体系中加入2 μl DNase I, RNase-free (1 U/µl)，混匀后快速离心一下，将溶液沉淀至离心管底部。37ºC孵育30 min，若出现模板未消化完全的现象，可根据情况适当延长消化时间。在转录体系中加入适量0.5 M EDTA溶液（pH8.0）以停止反应。

注：

1) 在标准的RNA聚合酶反应中，1 μg线性化DNA模板（约3 kb）能够合成8-10 μg生物素标记的RNA （约500 nt）。通过放大反应组分，可以获得更多的生物素标记的RNA。

2) 合成的标记RNA的产量取决于模板DNA的数量、纯度和转录产物的长度。

3) 通常37ºC孵育2 h就可以获得接近最大的产量。延长孵育时间不会显著增加标记RNA的产量。

4) 标记的探针可以立即使用或保存备用，-20ºC可以短期保存，推荐在-80ºC冻存，并须尽量避免反复冻融。

5) 当生物素标记的RNA被用于与Northern blots或Southern blots杂交时，可以不进行本操作，因为生物素标记的RNA转录物的数量远远超过模板DNA。

3. RNA产物的纯化：

通常情况下，RNA转录产物可以通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀或使用柱纯化的方法进行纯化；对于需要精确控制转录产物长度的情况，建议使用凝胶电泳和切胶回收纯化的方法。

a. 苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀

苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀RNA转录产物通常是实验室常规操作去除蛋白质和大多数游离核苷酸的首选方法。

(a) 加入160 µl Nuclease-free Water将反应体积放大到180 µl，再加入20 µl 3 M醋酸钠（pH5.2）或20 µl 5 M醋酸铵，充分混匀。加入等体积的苯酚/氯仿混合液（1:1）抽提一次（剧烈Vortex 20-30 sec，随后14000×g离心5-10 min取上清），用氯仿抽提1-2次（每次剧烈Vortex 20-30 sec，随后14000×g离心5-10 min取上清）。

(b) 用双倍体积的无水乙醇沉淀RNA，在-20ºC至少孵育30 min。随后14000×g 4ºC离心5-10 min沉淀RNA。

(c) 弃上清，用约500 µl预冷的70%乙醇洗涤沉淀。

(d) 用50 µl DEPC水或0.1 mM EDTA重悬并溶解RNA，在-80ºC储存。

b. 磁珠法纯化

磁珠法纯化相对操作比较简单，也无需离心操作。使用本方法进行纯化时，如果之前没有使用DNase I进行消化，那么就需要充分变性后确保RNA和DNA不形成杂合链的情况下，才能有效去除其中的DNA模板。如果希望去除DNA模板，更推荐使用DNase I消化，因为变性方法很难确保磁珠法纯化时没有杂合链。

c. 柱纯化法

柱纯化可以去除游离的核苷酸、蛋白及盐。纯化时加入80 µl Nuclease-free Water将反应体系补足至100 µl混匀。由于RNA产量较高，为了避免超过离心柱式RNA纯化柱的结合能力，需要对纯化柱的载量进行评估，再根据相应的产品说明书纯化RNA。使用本方法进行纯化时，如果之前没有使用DNase I进行消化，那么就需要充分变性后确保RNA和DNA不形成杂合链的情况下，才能有效去除其中的DNA模板。如果希望去除DNA模板，更推荐使用DNase I消化，因为变性方法很难确保本方法纯化时没有杂合链。

d. 凝胶回收纯化法

当需要高纯度和特定长度的RNA转录产物时，建议凝胶电泳后切胶回收纯化。凝胶电泳可以根据转录产物的长度选择琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。

4. RNA转录产物的分析和检测：

a. 紫外吸收定量分析

通过测定A260计算体外转录获得的RNA的量，通过A260/280和A260/A230来判断获得的RNA的纯度。对于单链RNA，1OD对应的RNA浓度为40 µg/ml。

b. 转录产物的凝胶电泳分析

为了评估转录产物的长度，完整性和产量，可以使用适当的变性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。大于200 nt的转录产物可以使用变性琼脂糖凝胶进行电泳分析。小于200 nt的转录产物可以使用变性聚丙烯酰胺凝胶(5-15%)进行电泳分析。凝胶电泳都应在变性条件下进行，以最大程度地减少RNA二级结构对电泳迁移率的影响。

c. RNA产物的检测

本试剂盒转录合成的带生物素标记的RNA探针可以使用荧光基团、酶或抗体偶联的链霉亲和素 (Streptavidin) 进行检测。