SP6 RNA Polymerase

▍产品信息

SP6 RNA Polymerase，即SP6 RNA聚合酶，是一种高度特异识别SP6启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。SP6 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA SP6 启动子下游NTP的掺入，合成与SP6启动子下游的模板DNA互补的RNA。

SP6 RNA Polymerase不仅可以进行常规的RNA合成，还可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于SP6启动子有高度的特异性。

▍产品应用

用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定（RNase protection assay），反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。

▍产品保存

-20℃保存。

▍产品组分

组分编号	组分名称	组分规格
HX2009-1	SP6 RNA Polymerase (20 U/µl)	50 µl	250 µl	1.25 ml	1.25 ml×4
HX2009-2	10X SP6 Transcription Buffer	100 µl	500 µl	1.25 ml×2	1.25 ml×8

▍注意事项

1. 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

2. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. RNA合成：

a. DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。

b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。

c. 参考如下表格设置反应体系：

试剂	体积
10X SP6 Transcription Buffer	2 µl
NTP Mixture (10 mM each)	4 µl
线性DNA模板	0.2-1 µg
Ribonuclease Inhibitor (40 U/µl)	0.5 µl
SP6 RNA Polymerase (20 U/µl)	0.8-2 µl
补充经DEPC处理的去离子水	至20 µl

d. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀（可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀），随后离心沉淀液体。

e. 37ºC 孵育1~2 h。

f. 加入2 µl 0.5 M EDTA (pH 8.0)到反应体系中混匀或-20ºC冷却终止反应。

g. 电泳分析转录产物，或通过其他适当方法鉴定转录的效率

注：

1) 转录需在无RNA酶条件下进行。

2) 反应体系需在室温条件下配置，4ºC有亚精胺（spermidine）存在时DNA可发生沉淀。按以上反应条件，每1 µg 模板DNA可合成超过10 µg的RNA。

3) 如果模板DNA的线形化不太完全，会导致转录出比预期长度更长的RNA，同时使预期长度的转录本比例下降。

4) 可根据实际情况按照比例放大或缩小上述反应体系。

2. 放射标记RNA的合成：

a. DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。

b. 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。

c. 参考如下表格设置反应体系：

试剂	体积
10X SP6 Transcription Buffer	2 µl
3 NTP Mixture (10 mM each , without CTP)	1 µl
100 µM CTP	2.4 µl
[α-³²P]-CTP, ~30TBq/mmol (800 Ci/mmol)	1.85 MBq (50 µCi)
线性DNA模板	0.2~1 µg
Ribonuclease Inhibitor (40 U/µl)	0.5 µl
SP6 RNA Polymerase (20 U/µl)	1-2 µl
补充经DEPC处理的去离子水	至20 µl

d. 37ºC孵育1~2 h。

e. -20ºC冷却终止反应。

f. 分析和检测RNA的标记效率。

注：

1) 按以上方法合成的RNA活性一般为3-5 ×10⁸ dpm/µg。

2) 上述标记反应中也可以使用[³²P]、[³⁵S]或[³H]标记的其他NTP。使用其他放射性标记的NTP时，其他的NTP需作相应调整。20 µl反应体系各成分推荐使用剂量分别为：1.85 MBq (50 µCi) 5'-[α-³²P]-CTP, ~30 TBq/mmol (800 Ci/mmol)；11.1 MBq (300 µCi) 5'-[α-³⁵S]-UTP, >37 TBq/mmol (>1000 Ci/mmol)；0.925 MBq (25 µCi) 5,6-[³H]-UTP, 1.1-2.2 TBq/mmol (30-60 Ci/mmol)。

3) 放射性标记NTP浓度低于12 µM时，全长转录本合成效率也会下降。

下载产品使用说明书

Q：转录效率低（RNA产量低）怎么办?

A：纯化模板DNA（线性化质粒或PCR产物），确保启动子完整，验证启动子序列（SP6启动子：ATTTAGGTGACACTATAG）。使用新鲜NTP（建议终浓度0.5-1 mM），优化Mg²⁺浓度（可梯度测试4-8 mM），分装酶避免反复冻融，短期保存于-20℃，长期于-80℃。

Q：含有非特异性转录（杂带或长片段）怎么办？

A：彻底线性化模板（酶切后凝胶验证，避免残留超螺旋DNA）。纯化模板（如凝胶回收或柱纯化）。减少酶用量或缩短反应时间（通常1-2 h足够）。

Q：转录后RNA降解怎么办？

A：使用RNase-free耗材（DEPC处理水、枪头等）。添加RNase抑制剂（如RNasin）。转录后立即置于冰上，长期保存于-80℃（可加EDTA螯合金属离子）。

Q：有副产物（如dsRNA或双链）怎么办？

A: 纯化单链模板或设计单向转录载体。优化模板序列（避免反向重复或互补区）。

产品货号	产品规格	目录价	促销价
HX2009S	1 KU	151.00	136.00
HX2009M	5 KU	459.00	413.00
HX2009L	25 KU	1610.00	1449.00
HX2009XL	100 KU	5409.00	4868.00