一、 Illumina平台RNA文库构建。

1. 第一链cDNA的合成（1 st Strand Synthesis）：将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。

a. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表9所示，配制第一链cDNA合成的反应液。

表9 第一链cDNA合成反应体系

b. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

c. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表10所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表10 第一链cDNA合成反应程序

2. 第二链cDNA的合成/末端修复/加A（2nd Strand Synthesis/dA-Tailing）：

a. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表11所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表11 第二链cDNA合成反应体系

注：如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的Buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的Buffer。

b. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

c. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表12所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表12 第二链cDNA合成反应程序

3. 接头连接（Adapter Ligation) ：可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina接头。

a. 参考表1-1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。

b. 将表13中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

c. 于步骤2结束后的PCR管中继续配制表13所示反应体系。

表13 Adapter Ligation 体系

注：Ligation Enhancer 使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。本公司接头原始浓度为15 μM, 请根据表1-1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积DNA Adapter固定为5 μL。

d. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

e. 将PCR管置于PCR仪中，设置表14所示反应程序，进行接头连接反应：

表14 Adapter Ligation 反应程序

4. 连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）：本方案适用于片段＜200 bp时，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片段≥200 bp时，参照附录2的分选方案，通过纯化、分选获得目标长度的文库。适用于插入片段<200 bp的文库（需进行两轮纯化）。

a. 准备工作：将NGS DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。

b. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

c. 吸取60 μL NGS DNA Selection Beads（0.6×，Beads：DNA=0.6:1）至Adapter Ligation 产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

d. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

e. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

f. 重复步骤e，总计漂洗两次。

g. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

h. 将PCR管从磁力架中取出，加入52 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。

i. 吸取40 μL NGS DNA Selection Beads（0.8×，Beads：DNA=0.8:1）至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

j. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

k. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。

l. 重复步骤k，总计漂洗两次。

m. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

n. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

5. 文库扩增（Library Amplification）：将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

a. 将表15中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

b. 于无菌PCR管中配制表15所示反应体系。

表15-A 短接头连接产物PCR反应体系

表15-B 长接头连接产物PCR反应体系

注：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂中配备的Index primer进行扩增。**如果使用的是Indexed Adapter，俗称长接头（大Y接头），可用NGS Primer Mix for Illumina进行扩增。

c. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

d. 将PCR管置于PCR仪中，设置表16示反应程序，进行PCR扩增。

表16 PCR扩增反应程序

注：文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整，详见注意事项2。

6. 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）：

a. 准备工作：将NGS DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

b. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

c. 吸取45 μL NGS DNA Selection Beads（0.9×，Beads：DNA=0.9:1）至Adapter Ligation 产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

d. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

e. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

f.  重复步骤e，总计漂洗两次。

g. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

h. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

7. 文库质量控制：通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项3。

二、 MGI 平台 RNA文库构建。

1. 第一链cDNA的合成（1st Strand Synthesis）：将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。

a. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表17所示，配制第一链cDNA合成的反应液。

表17 第一链cDNA合成反应体系

b. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

c. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表18所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表18 第一链cDNA合成反应程序

2. cDNA的合成/末端修复/加A（2nd Strand Synthesis/dA-Tailing）：

a. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表19所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表19 第二链cDNA合成反应体系

注：如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的Buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的Buffer。

b. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

c. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表20所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表20 第二链cDNA合成反应程序

3. 接头连接（Adapter Ligation）：可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的MGI接头。

a. 参考表1-2，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。

b. 将表21中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

c. 于步骤2步结束后的PCR管中继续配制表21所示反应体系。

表21 Adapter Ligation 体系

注：Ligation Enhancer 使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。本公司接头原始浓度为10 μM, 请根据表1-2的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头DNA Adapter添加体积固定为5 μL。

d. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

e. 将PCR管置于PCR仪中，设置表22所示反应程序，进行接头连接反应：

表22 Adapter Ligation 反应程序

4. 连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）：本方案适用于片段＜200 bp时，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片段≥200 bp时，参照附录3的分选方案，通过纯化、分选获得目标长度的文库。适用于插入片段<200 bp的文库（需进行两轮纯化）

a. 准备工作：将NGS DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min，同时配制80%乙醇。

b. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

c. 吸取60 μL NGS DNA Selection Beads（0.6×，Beads：DNA=0.6:1）至Adapter Ligation 产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

d. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

e. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

f. 重复步骤e，总计漂洗两次。

g. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

h. 将PCR管从磁力架中取出，加入52 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。

i. 吸取40 μL NGS DNA Selection Beads（0.8×，Beads：DNA=0.8:1）至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

j. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

k. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

l. 重复步骤k，总计漂洗两次。

m. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

n. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

5. 文库扩增（Library Amplification）：对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

a. 将表23中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

b. 于无菌PCR管中配制表23所示反应体系。

表23 接头连接产物PCR反应体系

注：primer mix for MGI不含在本试剂盒中，可用NGS Primer Mix for MGI进行扩增。

c. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

d. 将PCR管置于PCR仪中，设置表24示反应程序，进行PCR扩增。

表24 PCR扩增反应程序

注：文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整，详见注意事项2。

6. 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）：

a. 准备工作：将NGS DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min，同时配制80%乙醇。

b. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

c. 吸取45 μL NGS DNA Selection Beads（0.9×，Beads：DNA=0.9:1）至Adapter Ligation 产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

d. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

e. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

f. 重复步骤e，总计漂洗两次。

g. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

h. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

7. 文库质量控制：通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项3。