1. DNA变性/非变性PAGE电泳与切胶：

a. 根据所需分离纯化的DNA片段大小配制相应浓度PAGE胶，以达到最佳的有效分离效果，相关参数如下表所示。

b. 在DNA样品中按比例加入DNA上样缓冲液，混匀后上样。

注：变性PAGE凝胶上样前请反复吹打上样孔，将沉淀的尿素吹出上样孔，以获得更好的电泳效果。

c. 接通电源，电泳至所需位置。

d. 取出PAGE胶，放置到含有NA-Red等核酸染料的无DNA酶的水中，在侧摆摇床上缓慢摇动5-10 min。

e. 使用一次性手术刀片将含目的DNA片段的PAGE胶切下，请确保切下的PAGE胶尽可能小并免受其它DNA片段的污染。

2. 凝胶研磨：

用本试剂盒提供的研磨杵在离心管内把PAGE胶研磨至细粉末状。

3. DNA扩散：

a. 加入300 µl Buffer P1至PAGE胶粉末中，适当混匀。

b. 55ºC水浴60-90 min，以促进胶中DNA扩散到溶液中。

注：对于较大片段的目的DNA来说，可适当延长扩散时间，甚至37ºC过夜，以提高回收效率。孵育过程中可以适当混匀几次，促进DNA的扩散。如果能使用带有震荡或摇动功能的恒温孵育装置效果更佳。

c. 13,000 g离心5 min。

d. 小心吸取上清到新的离心管中，尽量避免吸取到凝胶。

e. 再次加入300 µl Buffer P1至凝胶粉末中，55ºC水浴30-60 min，适当混匀。

注：累计两次的扩散时间通常约2 h或以上就能获得较好的回收效果，扩散更长时间仅对长度明显偏长的DNA片段的回收效率提高有帮助。

f. 13,000 g离心5 min。将上清液再次转移至步骤3d相同的上清液收集管中。

4. 核酸沉淀：

a. 向上清液中加入1/10体积的Buffer P2，再加入2.5倍体积无水乙醇，混匀。

注：如果待回收的DNA量较少时，为提高回收效率，推荐使用Glycogen（核酸沉淀用），每次加入1-3 µl，可以大大提高DNA沉淀效率。

b. -20ºC或-80ºC孵育30 min。

注：低温孵育有助于小片段核酸的充分沉淀，温度越低，孵育时间越长，沉淀效率越高。

c. 4ºC，13,000 g离心10 min。

5. 洗涤：

a. 小心去除上清，加入500 µl Buffer WB，轻轻混匀。

注：去除上清时需要尽量小心，以避免沉淀的丢失。

b. 4ºC，13,000 g离心5-10 min。

c. 如有必要，重复步骤5a和5b一次。如果不希望洗涤2次，DNA乙醇沉淀后，一定要充分吸除上清，并且第一次洗涤后也需要充分吸除上清。

6. 晾干与溶解：

小心吸净残留液体，室温晾干，加入30-50 µl Buffer EB溶解沉淀，即为纯化回收的DNA片段溶液。

注：吸净残留液体的情况下，通常1 min内就会晾干。适当干燥即可，过度干燥会导致后续溶解速度非常缓慢。