1. DNA变性/非变性PAGE电泳与切胶：

a. 根据所需分离纯化的DNA片段大小配制相应浓度PAGE胶，以达到最佳的有效分离效果，相关参数如下表所示。

b. 在DNA样品中按比例加入DNA上样缓冲液，混匀后上样。

注：变性PAGE凝胶上样前请反复吹打上样孔，将沉淀的尿素吹出上样孔，以获得更好的电泳效果。

c. 接通电源，电泳至所需位置。

d. 取出PAGE胶，放置到含有NA-Red等核酸染料的无DNA酶的水中，在侧摆摇床上缓慢摇动5-10 min。

e. 使用一次性手术刀片将含目的DNA片段的PAGE胶切下，请确保切下的PAGE胶尽可能小并免受其它DNA片段的污染。

2. 凝胶研磨：

用本试剂盒提供的研磨杵在离心管内把PAGE胶研磨至细粉末状。

3. DNA扩散：

a. 加入300 µl Buffer P1至PAGE胶粉末中，适当混匀。

b. 55ºC水浴60-90 min，以促进胶中DNA扩散到溶液中。

注：对于较大片段的目的DNA来说，可适当延长扩散时间，甚至37ºC过夜，以提高回收效率。孵育过程中可以适当混匀几次，促进DNA的扩散。如果能使用带有震荡或摇动功能的恒温孵育装置效果更佳。

c. 13,000 g离心5 min。

d. 小心吸取上清到新的离心管中，尽量避免吸取到凝胶。

e. 再次加入300 µl Buffer P1至凝胶粉末中，55ºC水浴30-60 min，适当混匀。

注：累计两次的扩散时间通常约2 h或以上就能获得较好的回收效果，扩散更长时间仅对长度明显偏长的DNA片段的回收效率提高有帮助。

f. 13,000 g离心5 min。将上清液再次转移至步骤3d相同的上清液收集管中。

4. 纯化柱吸附：

a. 向上清液中加入700 µl Buffer P2，振荡或吹打混匀，室温放置1 min。

b. 将混合液（包括沉淀物）分两次转移至纯化柱内，每次13,000 g离心30 sec后倒弃收集管内液体。

注：加入Buffer P2后溶液总体积会超过纯化柱的容量（约700 µl），因此须分成2次过柱，即将一半的混合物（约650-700 µl）加入纯化柱内后12000 g离心30 sec，倒弃收集管内液体，再将剩余的混合物加入纯化柱内12000 g离心30 sec，并倒弃收集管内液体。

5. 洗涤：

a. 加入600 µl Buffer WB，13,000 g离心30 sec，倒弃收集管内液体。

b. 重复步骤5a一次。

6. 洗脱：

a. 13,000 g离心2 min，充分去除残留液体。

b. 将DNA纯化柱置于本试剂盒提供的洗脱管中，加入30-50 µl Buffer EB，室温放置2-3 min。

c. 最高速（约12,000-16,000 g）离心30 sec，所得溶液即为经PAGE纯化的DNA。

注：Buffer EB需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把Buffer EB的体积减小至20 µl，但洗脱下来的总DNA量会相对减少。室温较低时，Buffer EB在37ºC预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量10-35%的DNA。