1. 取过夜菌至3个1.5 ml离心管中，5000 g离心1 min收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3 ml过夜菌沉淀。

注：通常大肠杆菌宜用LB培养过夜（16 h左右）至OD值为2-4。建议5000 g（通常为5000 rpm左右）室温离心1 min，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入Buffer S1后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约1.5 ml菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上（可用普通草纸），使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过5 ml，对于低拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过10 ml。过量的菌会导致后续的裂解不充分。

2. 每管加入250 μl Buffer S1，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

注：确认Buffer S1中已经添加了RNase A。最高速度vortex 5-10 sec或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。

3. 每管加入250 μl Buffer P1，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。

注：切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3 min，但总裂解时间不可超过5 min。

4. 每管加入350 μl Buffer P2，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

注：切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。

5. 最高速（13,000 rpm左右）室温离心10 min。离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱，废液收集管，并在纯化柱上做好标记。

6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60 sec，倒弃收集管内液体。再重复两次，使三管质粒结合于同一纯化柱上。

注：质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

7. 在质粒纯化柱内加入750 μl Buffer WB，最高速离心30-60 sec，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

注：加入Buffer WB后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

8. 再最高速离心1 min，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

注：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的Buffer WB。微量的Buffer WB会影响质粒的质量。

9. 将质粒纯化柱置于洁净1.5 ml离心管上，加入120 μl Buffer EB至管内柱面上，放置1 min。

注：Buffer EB需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果不慎将Buffer EB沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或Milli-Q级纯水替代Buffer EB，但是水的pH应不小于6.5。Buffer EB加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。

10. 最高速离心1 min，所得液体即为高纯度质粒。通常所得质粒浓度为0.1-0.3 mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。