1. 取过夜菌1.5 ml，5000 g离心1 min收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3 ml过夜菌沉淀。

注：通常大肠杆菌宜用LB培养过夜（16 h左右）至OD值为2-4。建议5000 g（通常为5000 rpm左右）室温离心1 min，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约1.5 ml菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上（可用普通草纸），使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过5 ml，对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过10 ml。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。

2. 每管加入250 µl Buffer S1，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

注：确认Buffer S1中已经添加了RNase A。最高速度vortex 5-10 sec或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。

3. 每管加入250 µl Buffer P1，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。

注：切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3 min，但总裂解时间不可超过5 min。

4. 每管加入350 µl Buffer P2，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。

注：切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。

5. 最高速（13,000 rpm左右）室温离心10 min。离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱，废液收集管，并在纯化柱上做好标记。

6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60 sec，倒弃收集管内液体。质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

7. 选做：在质粒纯化柱内加入500 µl Buffer PB，最高速离心30-60 sec，洗去核酸酶污染等杂质，倒弃收集管内液体。

注：本步骤对于从EndA⁺菌株如JM110、BL21（DE3）、TG1和HB101等中提取质粒并去除核酸酶污染是必须的，对于从其它任何具有较高核酸酶表达水平和糖类修饰水平的菌株中提取质粒也是非常必须的。参考表1，对于一些常用的EndA^-菌株如DH5α和XL-1 blue等如果后续仅用于酶切、PCR、反转录等常规分子生物学操作，并不需要本步骤。如果抽提获得的质粒用于细胞转染，宜增加本步骤。

8. 在质粒纯化柱内加入750 µl Buffer WB，最高速离心30-60 sec，洗去杂质，倒弃收集管内液体。

注：加入Buffer WB后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

9. 再最高速离心1 min，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

注：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的Buffer WB。微量的Buffer WB会影响质粒的质量。

10. 将质粒纯化柱置于洁净1.5 ml离心管上，加入50 µl Buffer EB至管内柱面上，放置1 min。

注：Buffer EB需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果不慎将Buffer EB沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或 Milli-Q级纯水替代Buffer EB，但是水的pH应不小于6.5。Buffer EB加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入35 µl Buffer EB洗脱。

11. 最高速离心1 min，所得液体即为高纯度质粒。通常所得质粒浓度为0.1-0.3 mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。