1. 样品处理：

a. 对于液体样品（血清、血浆、血液、病毒等）。按照1:3体积比添加TriZol LS，即每0.25 ml液体样品加入0.75 ml TriZol LS，用移液器轻柔吹打多次或颠倒数次混匀至溶液完全澄清、无粘稠物。对于组分较为复杂的液体样品（例如全血）建议先使用无RNA酶的PBS进行适当稀释，再按比例加入TriZol LS进行抽提。例如0.1 ml全血样品加入0.15 ml PBS后为0.25 ml，然后加入0.75 ml TriZol LS。对于无需稀释或稀释后但体积不足0.25 ml的样品，建议使用无RNA酶的PBS将样品体积调整为0.25 ml，或根据样品体积按照相应比例调整后续所使用试剂的体积。

b. 对于细胞悬液。离心收集细胞，吸尽液体，每100万至200万动植物细胞、酵母或细菌，加入0.25 ml无RNA酶的PBS重悬细胞。取0.25 ml细胞悬液加入0.75 ml TriZol LS用枪吹打或适当vortex，确保全部裂解。

注：某些酵母和细菌如裂解不充分，可使用研磨仪进行匀浆处理，确保全部裂解。

c. 对于组织样品。取20-80 mg组织，液氮冷冻后研磨成粉末，然后加入0.25 ml无RNA酶的PBS和0.75 ml TriZol LS的预混液，充分裂解组织。对于RNA完整性要求不是非常高的情况，可以免于液氮冷冻和研磨，对于相应的组织样品，加入1 ml PBS和TriZol LS预混液（1:3），使用研磨仪进行研磨，直至充分裂解。

2. RNA的提取：

a. 对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，TriZol LS裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。须12,000×g 4ºC离心10 min（或15,000×g 4ºC离心5 min），然后吸取澄清的TriZol LS裂解产物至一新的离心管中。

b. 每0.75 ml TriZol LS加入0.2 ml氯仿或RNA Extraction Buffer（氯仿替代品），vortex混匀或猛烈晃动15 sec，室温放置2-3 min。

c. 12,000×g 4ºC离心15 min，然后吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每0.75 ml TriZol LS建议吸取约0.5 ml，需避免吸到中间层造成DNA污染。

d. 按每0.75 ml最初的TriZol LS加入0.5 ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10 min。如果样品量非常少或者希望充分沉淀小RNA，可以-80ºC冻存至少1 h以上，以提高沉淀效率。

e. 12,000×g 4ºC离心10 min，在管底或邻近管底的侧壁处可见RNA沉淀，弃上清。

f. 每0.75 ml最初的TriZol LS加入1 ml 75%乙醇（DEPC水或超纯水配制），vortex或颠倒混匀。

g. 7,500×g 4ºC离心5 min，弃上清。再用离心机甩一下（>5,000 rpm, 离心1 sec），小心吸尽液体，注意不要吸到管底或侧壁的RNA沉淀。

h. 待RNA略干后，加入20-50 μl DEPC水（DNase、RNase free）或超纯水溶解，-80ºC冻存。

注：切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值可能会低于1.6。

3. DNA的提取：

a. 接RNA提取步骤2d，离心分层后，尽可能去除上层的水相后，保留中间相和红色有机相（下层）。

b. 每0.75 ml TriZol LS加入0.3 ml无水乙醇，颠倒数次混匀。室温孵育2-3 min。

c. 2,000×g在4ºC离心5 min以沉淀DNA，吸除上清。上清可能需要酌情保留，用于后续蛋白质的提取。

注：如果后续需提取蛋白质，吸取上清至一新的离心管中，-80ºC可存放1-2个月，操作步骤见步骤4。

d. 用1 ml含0.1 M柠檬酸钠溶液（pH8.5）的10%乙醇洗涤DNA沉淀。室温孵育30 min，期间轻柔颠倒混匀2-3次。

注：DNA在上述10%乙醇中2 h内稳定。

e. 2,000×g在4ºC离心5 min，弃上清。

f. 重复步骤3d-e步骤一次。

注：对于>200 μg的DNA，步骤3d-e须重复两次，即共计3次。

g. 每最初0.75 ml TriZol LS加入1.5 ml 75%乙醇洗涤DNA沉淀，室温孵育10-20 min，期间轻柔颠倒混匀2-3次。

注：加入75%乙醇的DNA沉淀在4ºC可存放1-2个月。

h. 2,000×g在4ºC离心5 min，弃上清。

i. 室温放置晾干DNA沉淀数分钟，无明显液体后，加入适量DNA溶解液（8 mM氢氧化钠）或自行选择的适当溶液溶解。可60ºC温浴或适当增加DNA溶解液的量以促进DNA溶解。

注：提取的DNA沉淀可能不易溶于水和中性Tris缓冲液中，因此建议使用温和碱性溶液溶解DNA。后续可以在溶解后再调节pH至适当的pH值。

4. 蛋白质的提取：

a. 接DNA提取步骤3c，取沉淀DNA后的上清。

b. 每最初0.75 ml TriZol LS加入1.5 ml无水异丙醇，室温孵育10 min。

c. 12,000×g在4ºC离心10 min，弃上清。

d. 用含0.3 M盐酸胍的95%乙醇作为洗涤液洗涤蛋白质沉淀。每最初0.75 ml TriZol LS加入1.5 ml洗涤液，室温孵育20 min。

注：蛋白质在上述洗涤液中，4ºC可保存一个月，-20ºC可保存一年。

e. 7500×g在4ºC离心5 min，弃上清。

f. 重复步骤4d-e 2-3次。

g. 每最初0.75 ml TriZol LS加入1.5 ml无水乙醇，Vortex混匀。室温孵育20 min。

h. 7500×g在4ºC离心5 min，弃上清。

i. 室温放置晾干蛋白质沉淀5-10 min，用200 μl蛋白溶解液（1% SDS溶液）溶解蛋白质，反复吸打，可50ºC温浴以促使其完全溶解。

j. 10,000×g在4ºC离心10 min去除不溶物。

k. 分离得到的蛋白质样品可用于下游实验或-20ºC保存备用。