血液mRNA提取试剂盒（磁珠法）

▍产品信息

血液mRNA提取试剂盒（磁珠法）是一种使用Oligo (dT)₂₅包被的磁珠，配合优化的缓冲体系，用于稳定、高效、便捷地从新鲜、冻存、经EDTA、肝素等抗凝处理或经过血液RNA稳定保存液保存的血液中快速分离纯化出高纯度完整mRNA的试剂盒。提取的mRNA可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验，还可用于mRNA疫苗的研发等。一个典型的哺乳血液细胞中，四种主要的大分子的质量和占比为：RNA, ~20 pg (1%); DNA, ~7 pg (0.3%); protein, ~500 pg (20%); polysaccharide (多糖), ~2 μg (78.7%)。信使RNA (messenger RNA, 简称mRNA)约占总RNA质量的4%，核糖体RNA (ribosomal RNA, 简称rRNA)约占80%。 Oligo (dT)₂₅磁珠表面共价修饰了25聚dT序列即Oligo (dT)₂₅，当血液的裂解液与Oligo (dT)₂₅磁珠混合后，磁珠表面的寡聚dT序列与mRNA 3'端的poly(A)进行碱基配对而特异性结合，然后在外界磁场的作用下，磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离，经洗涤充分去除杂质，最后用洗脱液将mRNA从磁珠上洗脱下来，即可获得高纯度完整mRNA。具有提取效果稳定、纯度高、速度快、操作便捷等优点，mRNA提取体系经过反复测试和优化，能从100 µl新鲜小鼠血液提取约0.1-1 µg mRNA。仅需孵育、洗涤、洗脱等简单的操作，整个纯化过程不超过15 min即可完成。所有操作都在同一个离心管中完成，操作便捷。本试剂盒中的Oligo (dT)₂₅磁珠粒径约为200 nm，浓度约为5 mg/ml。每毫克磁珠偶联的Oligo (dT)₂₅约为300-400 pmol，每毫克磁珠可纯化约2-3 µg mRNA。

▍产品应用

使用Oligo (dT)₂₅包被的磁珠，配合优化的缓冲体系，稳定、高效、便捷地从新鲜、冻存、经EDTA、肝素等抗凝处理或经过血液RNA稳定保存液保存的血液中快速分离纯化出高纯度完整mRNA，提取的mRNA可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验，还可用于mRNA疫苗的研发等。

▍产品保存

4ºC保存，一年有效。其中Buffer Beads长期不使用时，-20ºC保存，可以保存更长时间。

▍产品组分

组分编号	组分名称	规格 50 T	规格 200 T	规格 800 T
HX3025-1	Buffer Beads（Oligo (dT)₂₅磁珠悬浮液）	1 ml	4 ml	16 ml
HX3025-2	Buffer P1（裂解液）	30 ml	120 ml	480 ml
HX3025-3	Buffer P2（结合液）	30 ml	120 ml	480 ml
HX3025-4	Buffer WB1（洗涤液I）	30 ml	120 ml	480 ml
HX3025-5	Buffer WB2（洗涤液II）	60 ml	240 ml	480 ml×2
HX3025-6	Buffer EB（洗脱液）	5 ml	20 ml	80 ml

▍注意事项

1. 血液样品推荐使用血液RNA稳定保存液进行保存以保持RNA的完整性。

2. 操作过程要严格保证无RNA酶和DNA酶污染。本产品的所用试剂和耗材都要求是RNase-free和DNase-free的，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。如果可能有DNase污染，通常高温高压灭菌可以使DNase灭活。

3. 温度较低时，Buffer P1可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，可置于室温或者37ºC水浴溶解，混匀后使用。

4. 需自备磁分离装置。分装或使用磁珠时，请适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。请使用推荐的血液量，否则可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响提取获得的mRNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少总细胞量和总组织量。

5. 由于mRNA容易降解，提取获得的mRNA推荐尽快用于RT-PCR等后续实验。如果不能尽快使用，需要-80ºC保存。

6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 准备工作：

a. Buffer P1、Buffer P2、Buffer WB1和Buffer WB2使用前平衡至室温。Buffer EB在使用前置于冰上或者2-8ºC保存。如果溶液有沉淀，适当水浴或者振荡溶解。

b. 血液的准备：

(a) 收集50-100 µl新鲜的红细胞无细胞核的血液样品，或5-10 µl红细胞有细胞核的血液，加入含抗凝剂的抗凝管中，颠倒混匀。

注：

1) 人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核，鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内RNA的含量非常高。抗凝剂推荐使用EDTA钠盐或钾盐，肝素和柠檬酸盐也可以。

2) 白细胞的收集和保存在血液RNA稳定保存液中的血液样品，请参考血液RNA稳定保存液的使用说明步骤1、2对血液样品进行处理。

(b) 按照血液量加入下表中推荐的Buffer P1。用移液器吹打多次，裂解细胞至溶液变粘稠。

(c) 选做：Buffer P1后样品可能会比较粘稠，可适当超声或使用1 ml注射器反复抽吸打断基因组DNA从而使粘稠感消失。此操作会产生泡沫，但不影响mRNA的得率。

(d) 4ºC以14,000×g离心5 min，并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化，或保存在-80ºC备用。

c. Buffer Beads的准备：

(a) 将磁珠溶液从4ºC冰箱取出，适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。参考下表，根据总细胞量或组织重量和样品数量，取适量的Buffer Beads至一洁净离心管中。

血液量	Buffer P1	Buffer Beads	Buffer WB1	Buffer WB2
<50 µl	100 µl	20 µl	500 µl	500 µl
50~100 µl	300 µl	40 µl	500 µl	500 µl
100~300 µl	600 µl	100 µl	500 µl	500 µl

(b) 无论磁珠用量多少，按照每个样品200 µl Buffer P2的量，加入适量Buffer P2洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离30 sec，去除上清。重复本步骤1次。

注：如果样品数量超过5个，可以考虑将适量Buffer Beads先直接置于磁力架上分离30 sec，去除上清，然后根据样品数量再加入适量Buffer P2洗涤两次。

(c) 按照每个样品100 µl Buffer P2的量，加入适量Buffer P2重悬磁珠。

2. 从血液中抽提mRNA：

a. 取上述制备好的血液样品与100 µl洗涤后的磁珠在室温下旋转混合5 min。

b. 置于磁力架上分离1分钟，去除上清。

c. 室温下用500 µl Buffer WB1洗涤磁珠，磁分离30 sec，去上清。

注：该步骤可能会出现絮凝物，增加洗涤次数，可使磁珠分散均匀，絮凝减少，絮凝不影响mRNA的抽提。

d. 室温下用500 µl Buffer WB2洗涤磁珠，磁分离30 sec，去上清。重复本步骤1次。

e. 根据后续实验需求，进行mRNA的洗脱：从磁珠上洗脱mRNA：加入10-20 µl Buffer EB或Nuclease-free的水，75-80ºC孵育2 min，磁分离30 sec，然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中，置于冰上待用。如果mRNA不洗脱直接用于后续实验，如固相cDNA文库构建等，用500 µl Buffer WB2洗涤一次，再用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次，即可用于后续实验。

注：建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解，建议尽快进行后续实验。短时间内不使用，请置于-80ºC保存。

下载产品使用说明书

Q：为什么mRNA降解？

A：RNase污染：实验操作环境、耗材（吸头、离心管）、试剂或实验员本人携带RNase。

样本内源RNase：血液中含有大量RNase，裂解不迅速或不彻底会导致mRNA被降解。

温度不当：实验过程中在室温下放置时间过长，未在冰上操作。

储存问题：提取后的RNA未及时置于-80℃保存，或反复冻融等。

Q：为什么mRNA纯度不足（A260/A280、A260/A230比值异常）？

A：A260/A280偏低 (<1.8)：通常表示蛋白质污染（酚或胍盐残留）。

A260/A280偏高 (>2.2)：可能表示RNA降解或残留基因组DNA。

A260/A230偏低 (<1.8)：通常表示盐类（胍盐、乙醇）、碳水化合物或酚的残留。

产品货号	产品规格	目录价	促销价
HX3025S	50 T	365.00	328.00
HX3025M	200 T	1220.00	1098.00
HX3025L	800 T	3909.00	3518.00