1. 样品的准备：

a. 液体样品的准备：含病毒的血浆、血清、无细胞体液、拭子、细胞培养上清等样品，按照常规方法取样。每100 µl液体样品加入300 µl Buffer P1。轻轻颠倒混匀3-5次。

b. 选做：为提高病毒RNA的提取量，建议在不含或含很少细胞或者组织的样品中加入carrier RNA，每个病毒样品需要2-5 µg carrier RNA，直接添加至Buffer P1中即可。

c. 细胞样品的准备：收集50-100万左右带有病毒的细胞。对于悬浮细胞，1000-2000×g离心1 min后弃上清，加入300 μl Buffer P1，轻轻吹打8-10次至固悬物溶解、溶液澄清；对于贴壁细胞，吸净培养液后加入300 μl Buffer P1，轻轻吹打5-10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至一洁净离心管内。

d. 组织样品的准备：取15-20 mg带有病毒的动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600 μl Buffer P1。也可将组织置于1.5 ml离心管中，迅速加入600 μl冰浴预冷的Buffer P1，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8-10次，室温放置3-5 min。然后约14,000×g离心2 min，将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织（如肝组织、脑组织等）可以不用高速离心而直接进入步骤2。

注：细胞的数量一般不超过500万，不超过100万细胞宜使用300 μl Buffer P1，多于100万细胞宜使用600 μl Buffer P1。动物组织的用量一般不超过30 mg，用量过多可能会因裂解不充分导致得率下降。组织样品在裂解和离心后，离心管下部可能会有一些胶状物质，宜作为上清转移至下一步操作。如果弃除胶状物，会导致得率下降约30-50%。后续加入Buffer P2后胶状物会消失。离心是为了去除未匀浆充分的明显块状物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次数至溶液完全澄清。对于富含RNase的样品，Buffer P1中宜添加DTT至终浓度为40 mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。

2. 加入等体积Buffer P2至裂解产物中，轻轻颠倒混匀3-5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。

3. 将混合物（包括沉淀物）转移至纯化柱内，12,000×g离心30 sec，倒弃收集管内液体。

注：当Buffer P1的体积大于300 µl时，在加入等体积Buffer P2后，总体积会超过纯化柱的容量，这时应分成2次过柱，即将一半的混合物过柱后，再将剩余的混合物重复步骤3一次。对于一些特殊的样品，如出现溶液未完全通过时，可延长离心时间至1-2 min，或者加大离心力至16,000×g。对于一些能快速启动达到12,000×g的离心机，离心30 sec已经足够，对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30 sec离心宜调整为60 sec。

4. 加入600 µl Buffer WB1，12,000×g离心30 sec，倒弃收集管内液体。

5. 加入600 µl Buffer WB2，12,000×g离心30 sec，倒弃收集管内液体。

6. 重复步骤5一次。

7. 最高速（约14,000-16,000×g）离心2 min，去除残留的液体。

8. 将RNA纯化柱置于本试剂盒提供的RNA洗脱管中，加入30-50 µl Buffer EB，室温放置2-3 min，最高速离心30 sec，所得溶液即为纯化的病毒RNA样品。样品病毒RNA提取量可能会较少，用紫外分光光度计较难测出，建议用qRT-PCR法检测。

注：Buffer EB需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把Buffer EB的体积减小至20 µl，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，Buffer EB在37ºC预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的Buffer EB再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15-40%的RNA。