修饰性抗体制备
产品货号 | 产品规格 | 目录价 | 促销价 |
HX3021 | 50 T | 609.00 | 548.00 |
▍产品信息
石蜡包埋组织RNA提取试剂盒（离心柱式,>200 nt）是一种采用环保脱蜡方式去除石蜡后抽提切片样品中RNA的试剂盒。提取获得的RNA长度通常大于200个核苷酸（nucleotide, nt），可以应用于反转录、RT-PCR、qRT-PCR或转录组测序等下游实验，也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA抽提。福尔马林固定石蜡包埋（Formalin fixation and paraffin embedding, FFPE），常应用于癌症等疾病研究中保存离体组织的形态学和组织学结构，以便于运输和储存，是病理样品长期保存的主要方法之一。组织样品经福尔马林固定时，组织内细胞中的核酸和蛋白质等分子间随机交联，核酸出现片段化，因此难以获得高质量核酸。本试剂盒采用环保脱蜡法去除石蜡，以特殊的裂解条件释放FFPE组织样本中的RNA分子，最大程度地降低了福尔马林固定时组织内细胞中RNA与其它分子交联的不利影响，提取获得的RNA纯度高、完整性好、质量稳定。首先使用环保的脱蜡剂和蛋白酶K将FFPE样品脱蜡、消化，随后加入适合RNA结合到纯化柱上的缓冲液，然后加入到纯化柱内。通过高速离心，使RNA在穿过纯化柱的瞬间，结合到纯化柱上，随后通过四次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把RNA洗脱下来。提取获得的石蜡包埋组织样品RNA纯度高，RNA A260/A280的范围通常在1.8-1.9之间；使用安全、高效，通过特殊的柱纯化介质进行RNA分离纯化，能有效避免常规方法抽提RNA时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂；操作快速、便捷，采用柱纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，纯化RNA操作过程仅需约15 min即可完成。标准操作步骤抽提得到的RNA含有少量DNA，但如果按照可选步骤加入DNase I，就可以获得不含DNA的高纯度RNA。
▍产品应用
采用环保脱蜡方式去除石蜡后提取切片样品中RNA，提取获得的RNA长度通常大于200个核苷酸（nucleotide, nt)，可以应用于反转录、RT-PCR、qRT-PCR或转录组测序等下游实验，也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA抽提。
▍产品保存
Proteinase K -20ºC保存，其余均室温保存，一年有效。Proteinase K室温（15-25ºC）存放一周，活力无明显下降。
▍产品组分
组分编号 | 组分名称 | 规格 50 T |
HX3021-1 | Buffer S1（脱蜡剂） | 50 ml |
HX3021-2 | Buffer P1（裂解液） | 10 ml |
HX3021-3 | Buffer P2（结合液） | 15 ml |
HX3021-4 | Buffer WB1（洗涤液I，首次使用前加9 ml无水乙醇） | 51 ml |
HX3021-5 | Buffer WB2（洗涤液II，首次使用前加48 ml无水乙醇） | 16 ml |
HX3021-6 | Buffer EB（洗脱液） | 12 ml |
HX3021-7 | Proteinase K（蛋白酶K） | 0.6 ml |
HX3021-8 | RNA纯化柱及废液收集管 | 50套 |
HX3021-9 | RNA洗脱管 | 50个 |
▍注意事项
1. 如果希望获得更高质量的RNA，宜尽量使用新鲜固定和包埋的组织样品。拿到组织样品后尽快在4-10%福尔马林中固定，固定时间最好在8-24 h之间或更短时间，长时间固定会使RNA断裂更为严重。样品包埋前应确保彻底脱水，残留的甲醛可能抑制Proteinase K的消化等相关实验步骤。
2. 本试剂盒提取RNA依赖于样品类型、储存时间以及固定条件。样品固定时间和保存时间过长（＞1年）易破坏RNA完整性，无法抽提出长片段。石蜡包埋组织抽提得到的RNA，由于样品的特殊性，存在可能的断裂或降解，通常不建议用于需要全长RNA的下游应用。
3. 如需制备不含DNA的高纯度RNA，需自备DNase I。须提前备好无水乙醇和异丙醇。
4. FFPE样品56ºC和80ºC孵育，须提前做好准备。
5. 除特别说明外，每次Vortex应控制在5-10 sec左右。
6. 温度较低时Buffer P1或Buffer P2中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍，如有沉淀，55ºC水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
7. 所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴，所有离心也均在室温进行。
8. 废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。Buffer S1和Proteinase K对人体有呼吸道、生殖等特定器官毒性，或致畸致癌毒性，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
9. 第一次使用前Buffer WB1需添加9 ml无水乙醇，Buffer WB2需添加48 ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
10. Buffer WB1对人体有害或有刺激性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
11. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
1. 样品处理：
a. 石蜡包埋组织切片：取2-8张的石蜡切片（5-10 μm厚，表面积小于1×1 cm2）。
注：如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。
b. 福尔马林固定组织：取10-25 mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5 ml离心管中，加入500 μl的PBS, pH7.4（DNase, RNase & Protease free, Sterile），Vortex震荡混匀，12,000×g离心1 min后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2h开始操作。
2. 脱蜡和裂解：
a. 将石蜡切片置于1.5 ml离心管中，加入600 μl的Buffer S1，剧烈Vortex 30 sec，以充分脱蜡。福尔马林固定液中的组织样品无需加Buffer S1，直接转入步骤2h开始操作；如果石蜡样品过多，可以将Buffer S1用量增加至1 ml。
b. 室温，≥14,000×g离心5 min。
c. 小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。
d. 加入1 ml无水乙醇，Vortex混匀。
e. 室温，≥14,000×g离心5 min。
f. 小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。可以用新的10 μl吸头小心吸去残留的乙醇，有利于乙醇挥发。
g. 打开管盖，室温放置5-10 min直至残留的乙醇完全挥发。残留的乙醇会对RNA产生影响，可以将离心管置于37ºC环境下挥发乙醇。
h. 加入150 μl Buffer P1和10 μl Proteinase K，Vortex混匀，56ºC金属浴或水浴孵育15 min或直至样品完全裂解。
i. 将完全裂解的组织样本置于80ºC孵育15 min，之后短暂离心使管盖上的蒸发液体回到管中。
注：80ºC孵育对修复RNA变性解交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的RNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至80ºC再放入样本进行孵育。
j. 室温，14,000×g离心5 min，转移上清液（约150 μl）至新的离心管中，注意不要碰到沉淀。
k. 向上述新的离心管中加入290 μl Buffer P2，Vortex混匀；再加入670 μl异丙醇，Vortex混匀。加入结合液和异丙醇后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀彻底混匀，但不会干扰后续实验。
3. 纯化RNA：
a. 将600 μl步骤2k中的混合溶液加入到RNA纯化柱内。≥6000×g离心1 min。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
b. 将剩余的步骤2k中的混合溶液加入到RNA纯化柱内。≥6000×g离心1 min。倒弃废液收集管内液体。 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
c. 向纯化柱中加入500 μl Buffer WB1，≥6000×g离心1 min。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
d. 选做：清除DNA。如果希望获得不含DNA的高纯度RNA，可向RNA纯化柱中央加入80 μl含有10U DNase I的酶溶液，室温放置消化15 min。每 80 μl酶溶液按照71.8 μl超纯水加8 μl Reaction Buffer（10X）再加0.2 μl 50 U/μl DNase I混合配制而成。消化结束后，不需要进行离心等任何额外的操作，直接进入步骤3e。
e. 向纯化柱中加入500 μl Buffer WB1，≥6000×g离心1 min。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
f. 向纯化柱中加入600 μl Buffer WB2，≥14,000×g离心1 min。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
g. 重复步骤3f一次。
h. ≥14,000×g离心1 min，以去除残留的乙醇。不可把步骤3g的离心时间延长而省略本步骤，倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
i. 将RNA纯化柱置于一洁净的1.5 ml离心管上，加入30-100 μl Buffer EB。室温放置1-3 min。≥14,000×g离心1 min。所得液体即为纯化得到的RNA。
注：Buffer EB需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水。使用较小体积的Buffer EB可以使获得的RNA的浓度较高，但洗脱下来的RNA量相对较少。Buffer EB的pH对洗脱效率有很大影响，使用去离子水洗脱时应保证其pH值在7.0-8.5之间。如果对于获得较多量的RNA非常重要，可以在第一次洗脱后，再用同体积Buffer EB重复洗脱一次。第二次洗脱可增加RNA洗脱量，但会降低洗脱RNA的浓度。经65ºC预热过的Buffer EB可增加RNA的洗脱量。
Q：为什么RNA得率低？
A：组织样本本身问题：FFPE组织中的RNA已发生不同程度的化学降解和片段化。组织固定不及时、固定时间过长（超过24-48 h）、使用酸性福尔马林等都会导致RNA严重降解。
石蜡脱除不彻底：石蜡残留会抑制蛋白酶K的活性和后续的酶促反应（如逆转录），并堵塞离心柱，导致RNA结合效率下降。
蛋白酶K消化不完全：消化时间不够、温度不当或蛋白酶K活性失效，导致组织中的交联未被充分打开，RNA释放不完全。
RNA在纯化柱上结合或洗脱效率低：过柱时操作不当，如缓冲液比例错误、乙醇浓度不准、或离心力/时间不足等。
Q：为什么RNA纯度差（A260/A280或A260/230比值异常）？
A：蛋白污染（A260/A280比值偏低，通常<1.8）；有机溶剂残留（如酚、胍盐、乙醇，导致A260/230比值偏低，通常<2.0）；盐离子残留等。
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