石蜡包埋组织总RNA提取试剂盒（磁珠法）

RNA提取/石蜡包埋组织总RNA提取试剂盒（磁珠法）

采用环保脱蜡方式去除石蜡后提取切片中总RNA的试剂盒。

产品货号	产品规格	目录价	促销价
HX3020	50 T	776.00	698.00

▍产品信息

石蜡包埋组织总RNA提取试剂盒（磁珠法）是一种采用环保脱蜡方式去除石蜡后提取切片中总RNA的试剂盒。提取获得的RNA包含大分子量RNA和小RNA（<200 nt），也常被称为总RNA（Total RNA），可用于反转录、qRT-PCR或转录组测序等下游实验，也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA抽提。福尔马林固定石蜡包埋（Formalin fixation and paraffin embedding, FFPE），常应用于癌症等疾病研究中保存离体组织的形态学和组织学结构，以便于运输和储存，是病理样品长期保存的主要方法之一。组织样品经福尔马林固定时，组织内细胞中的核酸和蛋白质等分子间随机交联，核酸出现片段化，因此难以获得高质量核酸。本试剂盒采用环保脱蜡法去除石蜡，以特殊的裂解条件释放FFPE组织样本中的RNA分子，最大程度地降低了福尔马林固定时组织内细胞中RNA与其它分子交联的不利影响，提取获得的RNA纯度高、完整性好、质量稳定。首先使用环保的脱蜡剂和蛋白酶K将FFPE样品脱蜡、消化，释放出来的RNA在特定条件下与磁珠特异性结合。在外界磁场（如磁分离架）的作用下，磁珠与相应溶液可以快速高效地分离。随后通过四次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把RNA洗脱下来。提取获得的石蜡包埋组织样品总RNA纯度高，RNA A260/A280的范围通常在1.7-1.9之间；使用安全、高效，通过特殊的磁珠进行RNA分离纯化，能有效避免常规方法抽提RNA时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂；操作快速、便捷，采用磁珠纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，纯化RNA操作过程仅需约15-20 min即可完成。标准操作步骤抽提得到的总RNA含有少量DNA，但如果按照可选步骤加入DNase，就可以获得不含DNA的高纯度总RNA。

▍产品应用

采用环保脱蜡方式去除石蜡后提取切片中总RNA，提取获得的RNA包含大分子量RNA和小RNA（<200 nt），也常被称为总RNA（Total RNA），可用于反转录、qRT-PCR或转录组测序等下游实验，也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA提取。

▍产品保存

Proteinase K、DNase和Reaction Buffer（10X）-20ºC保存，其余均室温保存，一年有效。其中，Buffer Beads长期不使用时4ºC保存，可以保存更长时间，Proteinase K室温（15-25ºC）存放一周，活力无明显下降。

▍产品组分

组分编号	组分名称	规格 50 T
HX3020-1	Buffer S1（脱蜡剂）	50 ml
HX3020-2	Buffer P1（裂解液）	10 ml
HX3020-3	Buffer P2（结合液）	11 ml
HX3020-4	Buffer WB1（洗涤液I，首次使用前加34 ml无水乙醇）	26 ml
HX3020-5	Buffer WB2（洗涤液II，首次使用前加39 ml无水乙醇）	26 ml
HX3020-6	Buffer EB（洗脱液）	12 ml
HX3020-7	Proteinase K（蛋白酶K）	600 μl
HX3020-8	Buffer Beads（RNA磁珠悬浮液）	1 ml
HX3020-9	DNase	100 μl
HX3020-10	Reaction Buffer（10X）	500 μl

▍注意事项

1. 如果希望获得更高质量的RNA，宜尽量使用新鲜固定和包埋的组织样品。拿到组织样品后尽快在4-10%福尔马林中固定，固定时间最好在8-24 h之间或更短时间，长时间固定会使RNA断裂更为严重。样品包埋前应确保彻底脱水，残留的甲醛可能抑制Proteinase K的消化等相关实验步骤。

2. 本试剂盒抽提RNA依赖于样品类型、储存时间以及固定条件。样品固定时间和保存时间过长（＞1年）易破坏RNA完整性，无法抽提出长片段。

3. 石蜡包埋组织抽提得到的RNA，由于样品的特殊性，存在可能的断裂或降解，通常不建议用于需要全长RNA的下游应用。温度较低时Buffer P1或Buffer P2中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍，如有沉淀，55ºC水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。

4. 本试剂盒须将FFPE样品56ºC和80ºC孵育，使用本试剂盒须提前备好无水乙醇和异丙醇。

5. 如果不使用试剂盒提供的DNase进行处理，本试剂盒抽提得到的RNA会含有少量DNA。后续如进行某些对DNA残留敏感的实验时，需要在使用说明步骤3b后，在磁珠中加入适量DNase进行消化，具体请参考使用说明。如果基因组DNA消化不充分，可以加大DNase的用量或延长孵育时间。

6. 本试剂盒提供的所有试剂都是RNase-free，操作时应小心，避免被RNase污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩。

7. 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。除特别说明外，每次Vortex应控制在5-10 sec左右。

8. 本试剂盒需自备磁分离装置，磁珠在静置后会发生沉降，使用前一定要适当涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。请使用推荐的样品量。如果样品量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响抽提获得的RNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善抽提效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少样品用量。

9. 第一次使用前Buffer WB1需添加34 ml无水乙醇，Buffer WB2需添加39 ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。

10. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 样品处理：

a. 石蜡包埋组织切片：取2-8张的石蜡切片（5-10 μm厚，表面积小于1×1 cm²）。

注：如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。

b. 福尔马林固定组织：取10-25 mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5 ml离心管中，加入500 μl的PBS, pH7.4（DNase, RNase & Protease free, Sterile），Vortex震荡混匀，12,000×g离心1 min后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2h开始操作。

2. 脱蜡和裂解：

a. 将石蜡切片置于1.5 ml离心管中，加入600 μl的Buffer S1，剧烈Vortex 30 sec，以充分脱蜡。福尔马林固定液中的组织样品无需加Buffer S1，直接转入步骤2h开始操作；如果石蜡样品过多，可以将Buffer S1用量增加至1 ml。

b. 室温，≥14,000×g离心5 min。

c. 使用吸头小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。

d. 加入1 ml无水乙醇，Vortex混匀。

e. 室温，≥14,000×g离心5 min。

f. 小心吸去上清，注意不要碰到沉淀，可以用新的10 μl吸头小心吸去残留的乙醇，有利于乙醇挥发。

g. 打开管盖，室温放置5-10 min直至残留的乙醇完全挥发，残留的乙醇会对RNA产生影响，可以将离心管置于37ºC环境下挥发乙醇。

h. 加入150 μl Buffer P1和10 μl Proteinase K，Vortex混匀，56ºC金属浴或水浴孵育15 min或直至样品完全裂解。

i. 将完全裂解的组织样本置于80ºC孵育15 min，之后短暂离心使管盖上的蒸发液体回到管中。

注：80ºC孵育对修复RNA变形解交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的RNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至80ºC再放入样本进行孵育。

j. 室温，14,000×g离心5 min，转移上清液（150 μl）至新的离心管中，注意不要碰到沉淀。

k. 向上述新的离心管中加入200 μl Buffer P2，Vortex混匀，再加入300 μl异丙醇，Vortex混匀。

注：加入结合液和异丙醇后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀彻底混匀，但不会干扰后续实验。

3. 纯化RNA：

a. 向步骤2k中的混合物加入20 µl Buffer Beads（使用前务必混匀），轻柔混匀后，室温放置3-5 min。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。

b. 加入500 µl Buffer WB1，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒两次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。

c. 选做：如果略去本步骤，抽提得到的RNA会含有少量基因组DNA。后续如进行某些对基因组DNA残留较敏感的实验时，可在上一步骤洗涤后，在磁珠中加入80 µl含2 μl DNase的酶溶液（每80 µl酶溶液按照70 µl水加8 µl Reaction Buffer (10X）再加2 µl DNase混合配制而成），37℃震荡消化15 min。消化结束后，不需要任何额外操作，直接进入步骤3d。

d. 加入500 µl Buffer WB1，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒两次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。

e. 加入600 µl Buffer WB2，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒两次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。

f. 重复步骤3e一次。

g. 将离心管室温放置5-10 min，或置于37ºC烘箱5 min，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。

h. 加入50-100 μl Buffer EB，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3-5 min，其间甩动离心管1-2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20ºC保存。所得溶液即为纯化的总RNA。

注：如果有必要，可以使用超纯水洗脱RNA，Buffer EB的pH值对洗脱效率有很大影响，使用超纯水洗脱时应保证其pH值在7.0-8.5之间。如需获得更高浓度的样品，可把Buffer EB的体积减小至20 µl，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，Buffer EB在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的Buffer EB再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15-40%的RNA。

下载产品使用说明书

Q：为什么RNA得率低？

A：样本本身问题：组织块存放时间过长（数年甚至数十年）、固定处理不当（如固定时间过长、中性福尔马林缓冲失效变酸）、组织类型本身RNA含量低（如骨、软骨、纤维组织）。

脱蜡不彻底：石蜡残留会严重抑制后续的酶促反应（如DNase I消化），并影响裂解液与组织的接触，导致RNA释放不完全。

组织裂解或消化不充分：FFPE组织非常坚韧，蛋白酶K消化是打开组织、释放核酸的关键步骤。消化不彻底会直接导致低得率。

磁珠相关问题：磁珠保存不当、使用前未充分恢复至室温或未充分重悬，会导致吸附效率下降。

洗脱不充分：洗脱液体积过小、洗脱时间过短，或洗脱液pH值不正确。

Q：为什么RNA纯度差（A260/A280或A260/A230比值异常）？

A：蛋白污染（A260/A280 < 1.8）；有机物污染（A260/A230 < 2.0）；基因组DNA污染等。

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